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复合体Ⅰ（EC1.6.5.3）又称NADH-CoQ还原酶或NADH脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH传递给CoQ，同时可使O2还原生成O^2.-，是呼吸电子传递链上产生O^2.-的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性氧（ROS）生成状态。


复合体Ⅰ能够催化NADH脱氢生成NAD⁺，在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。

组分	规格
试剂一	25mL
试剂二	5mL
试剂三	0.5mL
试剂四	25mL
试剂五	1mL
试剂六	1支

保存：-20℃


紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

• 试剂六粉剂用时加入2mL蒸馏水，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
  
• 工作液的配制：临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

• 准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10μL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
  
• 将匀浆600g，4℃离心5min。
  
• 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
  
• 可选：上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ。
  
• 步骤4中的沉淀即为线粒体，加入200μL试剂二和2μL试剂三，超声波破碎，用于复合体Ⅰ酶活性测定。
  
  • 超声波破碎方法：冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次。

• 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
  
• 样本测定
  
  • 工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。
    
  • 在1mL石英比色皿中加入40μL样本、800μL工作液和60μL试剂六，立即混匀，记录340nm处初始吸光值A1和2min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

• 按蛋白浓度计算
  单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
  
  复合体Ⅰ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V_样×Cpr)÷T=1808×ΔA÷Cpr
  • 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
• 按样本鲜重计算
  单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
  
  复合体Ⅰ活力(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V_样÷V_样总)÷T=365×ΔA÷W
• 按细菌或细胞密度计算
  单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
  
  复合体Ⅰ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V_样÷V_样总)÷T=0.73×ΔA

V_反总：反应体系总体积，9×10^-4L；
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；
d：比色皿光径，1cm；
V_样：加入样本体积，0.04mL；
V_样总：加入提取液体积，0.202mL；
T：反应时间，2min；
W：样本质量，g；
500：细胞或细菌总数，500万。
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